综述了动物实验替代技术的发展及法规接受情况。介绍了替代动物实验的历史，阐述了在21世纪毒性测试新观念（TT21C）、有害结局通路（AOP）、整合测试等理论的指导下，组织重建和多器官人体芯片技术、干细胞技术、组学技术、非生物测试技术、高通量和高内涵技术等新技术对动物实验替代方法的促进分析了标准化的替代方法和个性化的体外方法在化学品、化妆品、药品和生物制品等健康相关产品评估中的应用。分析表明，替代技术不仅是实验动物学科的重要分支，也是一类研发和实验用的创新性工具，同时具有产业化的前景。
实验动物在医学和生物学发展中做出了重要的贡献。但无法否认的是，虽然人类通过动物实验获得了科学研究或实验数据，然而实验动物却不可避免地受到了生理或心理上残酷的伤害甚至死亡。早在20世纪50年代，实验动物学科兴起之初，就有学者提出了这样的疑问：无限制的动物使用是否必要？仁慈的动物实验需要建立什么原则？之后，Russell和Burch系统地提出了减少（reduce）、优化（refine）和代替（replace）动物实验的3R理论，成为实验动物学科发展的基础。特别是进入21世纪以来，替代技术在毒理学与药物开发中取得的进步，使其逐渐成为研究热点和新兴的学科分支。3R理论提出近60年来，简单可区分为3个阶段用。
起步和积累阶段（—）
实验动物替代技术源于19世纪初在西方国家兴起的动物保护和动物福利运动，以年英国政府发布的《马丁反残酷法案》为起点。西方动物保护和试验用动物福利研究逐渐得到重视，英国动物福利大学联盟（UFAW）于年启动了实验室仁慈技术研究的项目，项目结束之后的年，（Russell）和（Burch）在总结调研报告的基础上出版了著名的《Theprinciplesofhumaneexperimentaltechnique》（《仁慈实验技术原理》）。系统提出了3R原则，即通过使用无知觉的材料代替（replace）有意识的活体高等动物，在确保获取一定数量和精度的信息前提下尽量减少（reduction）动物使用量，采取优化措施（refinement）减轻动物痛苦的发生和严重程度。提出了相对代替和绝对代替的概念，指出可利用低等动物、高等植物、微生物方法和生化检测的方法代替动物测试，并极具远见性地提出充分开发组织培养的观念。年，DavidSymth在《Alternativestoanimalexperimentation》（《替代动物试验》）一书将3R统称为替代(Alternatives)，这个定义已被人们广泛接受。
3R理论提出以来，开拓了人们理性投入生命科学研究的思路，使得仁慈科学成为良好科学的前提，并激励科学家投入替代技术开发。3R原则一直影响着世界各国有关实验动物法规。目前，西方大多数国家的《实验动物福利法》均引入了3R原则。中国科学技术部年发布了《关于善待实验动物的指导性意见》。3R原则还影响到一些部门规章或行业法规的制定以及为数众多的生物医学研究中科研计划与实验程序的论证和实施程序等。例如欧盟《86//EEC保护用于科学目的的动物的欧盟议会和理事会指令》、中国的《GB/T—实验动物机构质量和能力的通用要求》等。科研人员必须在动物福利法规的框架范围内享有学术自由和最优地使用动物。
年，英国成立了医学试验用动物中替代法基金会（FRAME）成为全球最早的替代方法研究机构，年，美国霍普金斯大学公共卫生学院成立了动物实验替代方法研究中心（CAAT）；除了政府投入之外，化工、医疗、生物等行业协会和企业也投入大量人力和经费研发替代方法。在化妆品局部毒性测试领域，最早出现了利用离体大鼠皮肤、牛和猪的角膜、兔和鸡的眼球、血细胞进行皮肤刺激、眼刺激的技术和方法。20世纪80年代，体外细胞分离培养技术已趋于成熟，无血清培养技术也开始出现，利用细胞进行检测和实验的方法被开发出来，如在生物制品动物实验中，发明了组织培养技术代替非人灵长类测试脊髓灰质炎疫苗的技术。年，斯堪的那维亚细胞毒理学会启动了评价急性毒性体外方法的项目，通过上千种化学物质的测试，发现啮齿类动物的急性经口毒性与细胞毒性之间存在线性关系，提出了用细胞毒性预测急性经口毒性的方法。有的学者尝试优化动物实验程序，达到减少动物实验的目的，如开发了急性经口毒性的上下程序法、分类法和固定剂量法；德国学者发明了利用细胞毒性检测光毒性的方法，还开发了利用废弃的动物材料（牛角膜）进行眼刺激毒性测试的牛角膜混浊和渗透性方法（BCOP）；也有学者开始尝试体外三维构建人工皮肤替代物，用于化学品的皮肤刺激性测试。这些新颖的体外方法首先在开发机构和行业内得到应用，但面临标准化、验证和法规接受等难题。
法规接受阶段（—）
验证认可机制
年，欧洲替代方法验证中心（EuropeanCenterforValidationofAlternativeMethods，ECVAM）成立（年更名为替代动物实验欧盟联合参考实验室，EURL-ECVAM）。年，美国成立了由17个部委参与的替代方法验证部门间协调委员会（InteragencyCoordinatingCommitteeontheValidationofAlternativeMethods，ICCVAM），ICCVAM依据美国国会发布的《ICCVAM授权法案》行使职责，主要是技术协调和评估新研发的和修订的替代方法。年世界经济合作和发展组织（OECD）开始编制替代方法的验证指南。年，日本替代方法验证中心（JapaneseCenterfortheValidationofAlternativeMethods，JaCVAM）成立。近年来，韩国、印度和巴西的替代方法中心也相继成立。这些官方机构的成立旨在从国家和国家联盟的层面推动替代技术的进步，并协调和加快替代方法法规接受的步伐。随着ECVAM的成立，一些成熟方法开始进入验证和法规认可过程。年，ECVAM开始验证3T3细胞中性摄取光毒性测试方法，年，开始验证皮肤模型代替皮肤刺激性动物实验的体外方法。验证机构的成立，使得大量研发投入产生的新技术、新方法和新产品有了被法规认可的渠道，推动了替代技术的进步。
全球法规趋势
替代技术的兴起和取得的进步，推动着立法禁止化妆品动物实验走向议事日程。化妆品的动物实验禁令起始于20世纪90年代，早期发展缓慢，近10年来呈现井喷势头（表1）。欧盟早在年就开始了禁令的讨论，到年只有英国率先实施了化妆品动物产品测试禁令。年欧盟通过了/15/EC指令提出逐步淘汰动物试验的时间表；年3月，欧盟禁止了化妆品成品的动物试验；年，以色列实施了产品测试禁令；年3月，欧盟禁止了化妆品成分的动物实验，仅限于一些最为复杂的人类健康效应可进行动物试验（如重复剂量系统毒性、皮肤致敏、致癌、生殖毒性和毒代动力学）；年3月11日起，欧盟完成了化妆品及成分的动物试验禁令和销售禁令的实施。
表1世界各国实施化妆品动物实验禁令/限令的时间
欧盟的立法和令行禁止对全球法规和替代方法的研究带来深远的影响。紧随其后，挪威、巴西年通过了70/法案，并于年3月进行了修订。澳大利亚于年及年先后提出两套终止残忍化妆品的相关法案，从年7月起实施化妆品动物试验及销售禁令。新西兰于年通过《动物福利法》修订案，禁止在化妆品及成分研发、制造、测试和教学中使用动物实验。以色列继年实施化妆品试验禁令之后，于年1月起，实施销售禁令。印度自年5月和11月，分两步实施了禁止化妆品动物检测和禁止进口经动物检测的化妆品。土耳其规定从年1月开始禁止化妆品成品和原料的动物实验。俄罗斯在年8月提交了提案，计划年实施，目前这个议案发回修改。中国台湾省于年通过，自年起禁止化妆品成品及原料动物实验。韩国则在年2月起实施了禁止化妆品动物实验的新法规，但提出了很多豁免条件。瑞士年宣布与欧盟采取一致原则。危地马拉在年2月国会上通过了化妆品动物实验禁令。
全球还有十几个国家目前正在立法的讨论进程中。例如美国于年提出人道化妆品法案，目前有个席位的支持。年，加拿大参议院提出零残忍化妆品法案议案S-,年改为S-，计划在加拿大境内禁止进行化妆品动物实验，并禁止销售经动物实验测试的化妆品原料和成品。此外，阿根廷、智利都有相关提案提出。全球目前有38个国家/地区已经正式实施了化妆品动物试验禁令。相信不久的未来，化妆品动物实验禁令会是全球重要经济体的一个共同原则。
化学品方面，欧盟年发布的REACH法规（化学品注册、评估、许可和限制制度）明确提出采用经验证的替代法来避免动物实验，鼓励研究新的非动物实验方法并在将来的法规中进行修改。年1月1日，欧盟27国开始实施新的保护试验用动物指令/63/EU，指令提出最终目的是完全替代科研和教学中的动物实验。新指令明确和重申了3R原则，呼吁委员会和成员国推广替代方法，鼓励成员国参与替代方法的验证等。
方法接受情况
科技进步始终是动物实验替代方法得以快速发展的驱动力量，表2列举了近15年来已获认可或已向OECD提交草案的毒性测试替代方法，这些方法包括皮肤腐蚀试验、皮肤刺激试验、经皮肤吸收试验、眼刺激试验、皮肤过敏试验、光毒性试验、内分泌干扰试验、胚胎毒性试验、血液毒性试验、遗传毒性等毒理学测试。此外，动物实验替代方法还包括应用于热源试验、疫苗生产、生物制品测试等医疗领域的方法。这些方法被欧洲药典、人用药品注册技术要求国际协调委员会（ICH）等法规接受。例如脊髓灰质炎疫苗的毒力测试废除了猴子实验，改用体外培养的细胞。生物制品的热源实验废除了兔子实验，改用血细胞测试等。
表2验证和法规接受的替代方法
表2验证和法规接受的替代方法（续）
以ECVAM的成立为标志，监管机构接受替代方法的速度明显加快，但总体但仍不能满足工业界和科学界风险评估的需要。欧洲消费者保护委员会（SCCS）年发布的第9版指南中明确指出：除了经验证的替代法，对于个案，SCCS可以接受一些科学有效的方法和新方法用于化妆品成分的安全评估。化妆品的应用情况表明，生物医药研究和产品评价对于替代方法的使用存在巨大需要，开发进度仍需加快。
中国在替代方法的标准认可方面也跟随了国际标准的发展趋势，例如化学品安全评价中国家标准（表3）已等同采用了替代方法，如《GB/T—化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验方法》和《GB/T—化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法》等。国家质检总局作为进出口商品的专职检验检疫监管机构，于年率先启动了替代方法系列标准的研制工作，为此，国家认证认可监督管理委员会成立了化妆品行业标准专家委员会，目前已发布相关替代方法标准共18项（表3），这批标准填补了国内相关标准的空白，并在检验检测工作中得到广泛应用。
表3中国已发布的替代方法国家标准和行业标准
表3中国已发布的替代方法国家标准和行业标准（续）
快速发展阶段（—）
新理论提出
动物实验替代技术在现代科学技术的推动下不断发展，特别是在毒理学领域，面临工业化带来的全球化学品评估的问题，制药工业发展带来的新药临床前安全评价问题，健康相关产业发展带来的环境和生态评价的问题等。年，美国国立研究院（NRC）提出了《Toxicitytestinginthe21stcentury:Avisionandastrategy》（《21世纪毒性测试-远景和策略》）的报告（简称TT21C），提出毒性测试应当由原来的体内动物研究向体外试验转变。TT21C发布的近10年来，各种策略和模式被提出，以实现报告提出的愿景。其中，有害结局通路（adverseout北京有没有准分子治疗白癜风的北京医院专业白癜风治疗
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